Статистический анализ показателей количества злокачественных новообразований в России свидетельствует о росте заболеваемости раком женских половых органов за последнее десятилетие. Число больных с впервые установленным диагнозом на 100 000 населения в 2007 году составило при раке шейки матки (РШМ) 15,9 (в Европе 14,2, в мире 11,1), при раке эндометрия (РЭ) 20,1 (в Европе 17,6, в мире 12,8), при раке яичников (РЯ) 15,4 (в Европе 13,5, в мире 10,3) [7]. При этом абсолютный прирост за 10 лет с 1997г был наиболее существенным при РЭ – 32,6%, при РЯ - 14,3%, при РШМ наименьший – 6,6%. В структуре онкологической заболеваемости за период с 1996 г. по 2006 г. отмечено снижение доли РШМ, увеличение доли РЭ. При этом РЭ находится на 5 месте – 7,0%, РШМ на 6 – 5,2%, РЯ на 7 месте – 4,9% [3,4]. За последние десятилетия во всех экономически развитых странах отмечается неуклонный рост заболеваемости РЭ. Почти все авторы отмечают, что 80-90% больных находятся в постменопаузе [8,10,11]. Тенденция к снижению доли больных с запущенными процессами (III-IV ст.), остается не столь явной (8,8% за 10 лет с 1997 г.). Максимальная запущенность отмечалась при РЯ (одна из самых высоких среди всех злокачественных опухолей) – 62,9% (соответственно, самая высокая смертность – 6 место среди всех злокачественных опухолей – 5,6%). При РЭ этот показатель находился на уровне 21,8% [3,7]. Средний возраст заболевших РШМ был 55,1 года, при РЭ 62,0 года, при РЯ – 58,5 года. Анализ динамики заболеваемости демонстрирует рост в периоде после наступления менопаузы (в среднем это возраст 51 год). Тенденция эта характерна для всех опухолей женской репродуктивной системы. Наиболее ярко она прослеживается при РЭ – с 11,4 в возрасте 40-44 года и 21,7 в 45-49 лет до 42,0 в возрасте 50-54 года и далее рост до максимума 59,7 и 58,9 в 60-69 лет. При раке яичников рост заболеваемости также предшествует наступлению менопаузы (с 14,6 в 40-44 года до 27,9 в 50-54 года). Далее число заболевших постепенно растет, достигая наибольших значений в 36,3-37,3 в возрасте 65-74 года. При РШМ заболеваемость возрастает, начиная после 30 лет, пик заболеваемости 29,0-29,4 приходится на возраст в 65-74 года [3,4,7].
Вирус папилломы человека (Human papillomavirus (HPV) is one of the most common causes of sexually transmitted infection (STI) in the world.ВПЧ) является одной из наиболее распространенных инфекций, передаваемых половым путем (ИППП) в мире. At least 20 million people in this country are already infected.Сама по себе инфекция ВПЧ – не заболевание. В большинстве случаев заражения иммунная система справляется с вирусом в течение года без какого-либо лечения. От момента инфицирования вирусом до клинических проявлений, а затем злокачественной трансформации, проходит достаточно длительный промежуток времени, более 10-20 лет. В постменопаузальном возрасте происходит кардинальная перестройка многих гомеостатических систем. В результате нарушаются механизмы взаимодействия макро-микроорганизм, изменяется баланс и регуляция микробиоценоза урогенитального тракта. В этой ситуации неустойчивого равновесия агрессивное взаимодействие инфекционного агента с клеткой приводит к возникновению опухоли.
Онкобелок Е7 поддерживает репликацию вируса в дифференцирующихся клетках, задерживая их терминальную дифференцировку, что блокирует экспрессию генов, контролирующих клеточное деление. Таким образом, онкопротеин Е7 ВПЧ способен стимулировать неконтролируемый синтез ДНК. И, наконец, онкопротеин Е7 подавляет индукцию генов, отвечающих активацией экспрессии под влиянием эндогенного интерферона. Таким образом, накопившиеся в онкогинекологии за последние два десятилетия факты свидетельствуют о связи инфицирования вирусом папилломы человека и развития рака женских половых органов, в основном, рака шейки матки. Роль ВПЧ в злокачественной трансформации других опухолей женского полового тракта остается недостаточно изученной. Целью нашего исследования явилось изучение данного инфекционного фактора при раке яичников, вульвы и раке эндометрия.
Распределение больных РЭ по стадиям было следующим: I стадия была у 43 (71,7%) больных, II стадия – у 7 (11,7%), III стадия – у 10 (16,6%). При ЗЭОЯ I стадия была диагностирована у 19 (28,4%) больных, II стадия – у 11 (16,4%), III стадия – у 31 (46,3%) и IV стадия – у 6 (8,9%). При РВ I стадия определялась у 17 больных, II стадия - у 19, III стадия - у 19 и IV стадия - у 25 женщин.
Онкобелок Е7 определялся методом двухстадийного иммуноферментного анализа. Диагностическая иммуноферментная система представляла собой набор реагентов для количественного определения белка ВПЧ 16 и 18 типа. Материал получали путем «соскоба» клеточного материала с поверхности опухоли эндобрашами и помещали в центрифужную пробирку. Результаты анализа учитывали спектрофотометрически при длине волны 450 нм. Для определения концентрации Е7 в исследуемых пробах необходимо построить калибровочный график по стандартным калибровочным образцам в координатах: ось абсцисс – концентрация Е7 (наг/мл); ось ординат – значение оптической плотности (ОП) образца. По полученным точкам проводили калибровочную кривую.
Полученные данные обрабатывались при помощи пакета статистических программ “SPSS 19.0 for Windows”. Для графического представления данных использовался MS Excel. При этом соблюдались общие рекомендации для медицинских исследований. Определялись арифметические величины (М), их ошибки (m). Для оценки статистической значимости различий (р-оценка) качественных данных использовались следующие критерии: 2 (хи-квадрат) Пирсона для четырехпольных таблиц (2 группы, дихотомические данные), критерий 2 (хи-квадрат) Пирсона с поправкой Йетса на непрерывность для четырехпольных таблиц и малых выборок. Для оценки статистической значимости различий (р-оценка) количественных данных применялся t-тест для сравнения двух групп; метод Ньюмена-Коулса (аналог t-теста) применялся для сравнения нескольких групп). Различия в полученных показателях считались достоверными при P < 0,05 (95% уровень значимости).
Последние годы принесли немало интересных эпидемиологических и клинических наблюдений в области молекулярной биологии, свидетельствующие о присутствии папилломавирусной инфекции (ПВИ) в тканях злокачественных эпителиальных опухолей яичников (ЗЭОЯ) [9,12,17,18]. Тем не менее, до настоящего времени подтверждений истинной причастности ВПЧ в процессе злокачественной трансформации эпителия яичников не получено. Все это и предопределило изучение нами целого ряда принципиальных моментов, обосновывающих и формирующих позиции инфекционной составляющей в канцерогенезе эпителиального РЯ. К их числу можно отнести: частоту сочетания ПВИ со ЗЭОЯ, специфичность ассоциации различных серотипов ВПЧ при серозном и муцинозном вариантах эпителиального РЯ и продукция специфического протеина Е 7 в тканях ЗЭОЯ.
Из таблицы 1 видно, что при ДНК-диагностике ПВИ в 51 (76,1%) из 67 случаев ЗЭОЯ ВПЧ был положительным. И только в 2 из 25 случаев (8,0%) нормальных тканей яичников зарегистрированы позитивные результаты (P = 2.4 x 10-9). Причем, частота определения ВПЧ в образцах серозного (n=52) и муцинозного (n=15) РЯ имела практически одинаковые значения – 75,0% и 80,0% соответственно. То обстоятельство, что ПВИ при различных вариантах РЯ выявляется статистически достоверно выше, чем в нормальных тканях, позволяет предположить ее роль в возникновении и развитии ЗЭОЯ [5].
Нами была проведена идентификация ДНК максимально широкого спектра типов ВПЧ как высокого онкологического риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 55, 58, 59, 66, 68, 73, 83), так и относящихся к низкой степени риска (6, 11, 42, 53, 54).
Установлено, что с наибольшей частотой эпителиальный рак яичников (РЯ) ассоциируется с ВПЧ-18 (29,9%), ВПЧ-52 (29,9%), ВПЧ-55 (26,9%), ВПЧ-83 (17,9%), ВПЧ-39 (16,4%) серотипами. ПВИ 73, 31, 51, 45, 33, 66, 68 и 16 типов определялась в 11,9%; 10,4%; 9,0%; 6,0%; 4,5%; 3,0%; 3,0% и 3,0% случаев соответственно (рис.1). Наряду с этим, ни в одном образце эпителиального РЯ не отмечено присутствие ВПЧ-35, ВПЧ-58 и ВПЧ-59 типов и ВПЧ низкого онкологического риска.
Подводя итоги, мы хотели бы подчеркнуть три важных обстоятельства. Во-первых, ПВИ, в частности ВПЧ 18, 52, 55, 83 и 39 серотипов, обладает высоким онкогенным потенциалом в отношении эпителиального РЯ. Во-вторых, несмотря на низкую частоту выявления ПВИ 73, 31, 51, 45, 33, 66, 68 и 16 серотипов, нельзя недооценивать их роль в канцерогенезе эпителиального РЯ. ВПЧ 35, 58, 59, 6, 11, 42, 53 и 54 серотипов необходимо трактовать как типы низкого онкологического риска развития ЗЭОЯ. И наконец, значимые различия в частоте детекции ВПЧ 18, 52 и 55 типов ВПЧ в пробах муцинозного и серозного РЯ указывают на важность дифференцированного подхода с позиций значимости того или иного серотипа в канцерогенезе различных вариантов эпителиального рака яичников.
Из 20 проб, забранных у больных эпителиальным РЯ I – IV стадий, продукция белка отмечена в 17 (85,0%) образцах преимущественно с ранними стадиями опухолевого процесса. Отсутствие вирусного протеина зафиксировано в 3 пробах больных распространенным РЯ. Это может быть объяснено тем фактом, что синтез онкопротеина Е 7, начало которого в клиническом эквиваленте проецируется на стадию предрака, вероятно, в течение развития опухолевого процесса имеет тенденцию к снижению. Показатель уровня ВПЧ-18 Е 7 протеина у пациенток варьировал в пределах пороговых значений и составил 0,3 – 1,2 нг/мл.
Таблица 3. Частота ДНК вируса папилломы человека при инвазивном раке вульвы (абс.число/ %)
Р < 0,05** число серотипов, сочетающихся с другими серотипами.
Наиболее часто при раке вульвы установлено наличие 6 и 11 серотипов. Причем, как правило, эти два серотипа выявлялись одновременно. Вероятно, подобная дупликация серотипов связана с крайне близкой идентичностью и последовательностью нуклеотидов в геноме папилломовируса человека у 6 и 11 серотипов. Были также зарегистрированы другие ассоциации. На материале наших исследований проявилась ассоциация 18 серотипа с 55 (1 наблюдение), с 59 (1 наблюдение), с 83 (1 наблюдение), 55 серотипа с 59 (1 наблюдение), 59 и 83 серотипа (1 наблюдение). Наряду с этим, не отмечено ни одного наблюдения ассоциации какого-либо серотипа с 16 серотипом. Как правило, 16 серотип выявлялся изолированно. Доля пациенток, у которых выявлены серотипы 16 и 18, трактуемые (на модели рака шейки матки) как серотипы высокого онкологического риска, на нашем материале установлены в 43,8% наблюдений [6].
На основании полученных данных можно предположить, что разделение серотипов на группы высокого и низкого риска весьма условно и, вероятно, это понятие следует рассматривать раздельно по отношению к каждой локализации плоскоклеточного рака. Один из возможных путей прояснения этого вопроса может быть связан с изучением присутствия белка Е7 в опухоли у больных раком вульвы. Мы изучили взаимосвязь стадии заболевания, дифференцировки опухоли и присутствия определенного серотипа вируса папилломы человека (табл. 4, 5).
Таблица 4. Частота серотипов вируса папилломы человека у больных раком вульвы в зависимости от стадии заболевания (абс.число/%)
Р < 0,05 * число серотипов, сочетающихся с другими серотипами
Из таблицы 4 видно, что при I стадии заболевания в большинстве наблюдений (58,8%) характерно наличие 6/11 серотипов (при P < 0,05). С равной частотой (11,8%) отмечено присутствие 16, 18 и 83 серотипов, причем в одном наблюдении 18 серотип сочетался с 83. В группе больных с I стадией выявлено еще одно сочетание серотипов – 59 с 83. В группе пациенток со II стадией рака вульвы частота 6/11 серотипов несколько меньше – 47,4%, но уже значительно с большей частотой диагностируется 16 и 18 серотипы – 21,1% наблюдений.
При III и IV стадии заболевания в основном доминируют 16 и 18 серотипы. Наряду с этим, в группах пациенток с III и IV стадиями рака вульвы в значительном числе наблюдений отмечено отсутствие вирусной инфекции (26,3% и 48,0% соответственно), при невысоких показателях 6/11 серотипов (5,3% и 8,0% соответственно). В целом, при выраженных формах рака вульвы (III и IV стадии вместе) частота отсутствия ВПЧ составляет 38,6%, в то время, как при I-II стадиях этот показатель всего 5,6% (при Р < 0,01). Наконец последнее, как видно из таблицы, сочетание серотипов чаще всего имеет место при I-II стадиях заболевания. При распространенных вариантах рака вульвы этот показатель резко падает.
Таблица 5. Частота серотипов вируса папилломы человека у больных раком вульвы в зависимости от дифференцировки опухоли (абс.число/%)
Р < 0,05* число серотипов, сочетающихся с другими серотипами
Из проведенного анализа вытекают три основных положения. Первое, при низкодифференцированном варианте плоскоклеточного рака вульвы у трети пациенток (30,8%) не удается установить присутствие ВПЧ, в то время, как при ороговевающем раке таких наблюдений значительно меньше – 10,7%. Второе, в дифференцированных вариантах опухоли чаще выявляется 6/11 и 18 серотипы (42,9 и 32,1% соответственно), чем это имеет место при неороговевающем раке (23,1 и 11,5% соответственно). Наконец, третье, сочетание серотипов в нашем исследовании проявилось лишь в группе больных, имеющих ороговевающий вариант плоскоклеточного рака. Ни в одном наблюдении с неороговевающей формой плоскоклеточного рака вульвы сочетание серотипов не отмечено.
В нашей работе иммуноферментный анализ на наличие онкобелка Е7 выполнен у 27 больных вирусассоциированным раком вульвы, у 20 из которых присутствовали ВПЧ 16 и 18. Во всех наблюдениях вирусассоциированного рака определялся онкобелок Е7.
Положительные пробы были получены только в тех наблюдениях, где имелись серотипы 16 и 18. Из 6 больных с вируснезависимым опухолевым процессом онкобелок Е 7 выявлен в 1 наблюдении. Теоретическое объяснение подобных фактов пока представляется не совсем ясным.
Таблица 6. Уровень онкобелка Е7 в опухолевой ткани вульвы.
Таким образом, место инфекционного фактора в этиопатогенезе рака вульвы можно определить следующим образом: возрастная инволюция кожи и слизистой оболочки (на фоне абсолютного дефицита эстрадиола, а также резкого снижения уровня стероидных рецепторов) – развитие инволютивно-атрофических процессов - изменение микробиоценоза вульвы (развитие условно патогенной и патогенной флоры) – формирование воспалительных и дистрофических изменений – индуцирование пролиферативных процессов – вклинивание на этом этапе вирусов - развитие дисплазии - прогрессия дисплазии в преинвазивный и инвазивный рак.
Роль инфекционного фактора в этой последовательности событий хоть и является вторичной, вместе с тем, ему принадлежит главная роль переключения инвалютивно-атрофической направленности состояния вульвы у пациенток постменопаузального возраста на индуцирование пролиферативных процессов.
Таким образом, полученные нами результаты, а также многочисленные литературные данные свидетельствуют о существенной роли инфекционного фактора в патогенезе таких злокачественных опухолей как рак вульвы и эпителиальный рак яичников, в то время как в возникновении рака эндометрия роль вирусной инфекции незначительна. Понимание механизма действия инфекционных агентов во взаимосвязи с изменениями гормонального статуса и микробиоценоза генитального тракта в постменопаузе дает возможность прояснить феномен роста онкологической заболеваемости ряда локализаций у женщин старше 50 лет. Начало и развитие злокачественной опухоли - это многофакторный и многоэтапный процесс, формирующийся в течение длительного времени. Построение эффективных программ современной диагностики и профилактики невозможно без представления о пусковых механизмах этого процесса. Иммуноферментный анализ на онкобелок Е7 открывает совершенно новые перспективы в проблеме ранней диагностики рака. Учитывая механизм экспрессии онкобелка, можно уверенно рекомендовать его в качестве теста для ранней диагностики процессов малигнизациии. Эта модель исследований совершенно по - новому формирует принципы отбора пациенток для последующей уточняющей диагностики и мониторинга. Ориентир на ранние сигнальные маркеры канцерогенеза усилит эффективность ранней диагностики рака репродуктивных органов у женщин и сделает более целенаправленным вторичную профилактику.
